Consejos para el cuidado de las columnas para HPLC
26 de mayo de 2025El cuidado adecuado de las columnas para HPLC es extremadamente importante para la duración de columna y para la calidad del análisis de HPLC. A continuación se detallan unas breves guías para el uso, almacenamiento y regeneración de las columnas para HPLC.
1. Uso de columnas para HPLC
La sílica es un material ideal para las columnas para HPLC ya que ofrece buena estabilidad mecánica, excelentes propiedades físico-químicas superficiales, una gran variedad de funcionalizaciones y es compatible con una gran variedad de disolventes orgánicos.
De todas maneras, los siguientes puntos son cruciales a la hora de trabajar con columnas de sílica.
Estabilidad de pH
En general, las columnas para HPLC en base sílica son estables en un rango de pH de 2 a 8. Soluciones tampón con valores de pH superiores a 8 atacan el esqueleto de la gel de sílice de forma hidrolítica. Valores de pH inferiores a 2 también conducen a procesos hidrolíticos durante los cuales se va separando fundamentalmente el recubrimiento superficial de la fase ligada. Las columnas llamadas de “nueva generación” suelen aceptar un rango de pH mayor. Por ejemplo, las columnas KromaPhase C18 Scharlau permiten un rango de pH de 1 a 10.
Estabilidad mecánica
Las fases estacionarias en base sílica son muy estables mecánicamente. Columnas bien empaquetadas pueden ser usadas a más de 400 (bar) (6000 psi) sin ningún problema. De todos modos, deben evitarse los golpes de presión que pueden producir caminos preferenciales en las columna lo que puede resultar en desdoblamiento de picos.
Muestra
Es muy importante también filtrar la muestra con un filtro de jeringa antes de introducirla en el sistema. Si la columna es de 4 o 4,6mm de diámetro interior se recomienda un filtro de 0,45μm. En cambio, si la columna es de 3 ó 2mm de diámetro interior se recomienda un filtro de 0,2μm.
Después del trabajo, lavar la columna, acondicionarla, desmontarla del sistema y cerrarla herméticamente.
Acondicionamiento
El tiempo de acondicionado de una columna depende de las dimensiones de la misma. En general, una columna está acondicionada después del paso 20 veces su volumen, es decir, 20 volúmenes de columna. En la tabla siguiente se detallan los tiempos de acondicionado necesarios para las dimensiones de columna más habituales.
Fases móviles (eluyentes)
Las columnas para HPLC en base sílica son compatibles con todos los disolventes orgánicos en el rango de pH mencionado más arriba. Para obtener los mejores resultados posibles es necesario usar disolventes de calidad HPLC filtrados a 0,45μm. No hay que olvidar que la columna irá recogiendo todas las partículas que entren en el flujo del sistema. El uso de precolumna alarga la vida de la columna de forma considerable. Además, la precolumna filtra partículas que provengan de la bomba, del inyector o de la misma muestra. Una alternativa a la precolumna es el filtro en línea que se colocan entre la columna y el inyector. Algunas mezclas de soluciones tampón tienen un efecto extremadamente corrosivo sobre el acero inoxidable. Citrato, tartrato e iones cloruro se deberían evitar. Donde sea posible, intentar cambiar las mezclas de tampones indicadas en las instrucciones por mezclas de tampones a base de fosfatos. Los restantes elementos del equipo de HPLC también se lo agradecerán. Cuando no queda más remedio que trabajar en condiciones poco favorables, se debería evitar mantener la columna durante un tiempo prolongado con estos eluyentes. Se aconseja eliminar las soluciones tampón con agua lo antes posible y reacondicionar la columna con un disolvente adecuado.
| Dim. columna (mm) | Vol. columna (ml) | Flujo (ml/min) | Tiempo (min) de equilibrado |
| 250×4,6 | 2,91 | 1,00 | 58 |
| 150×4,6 | 1,74 | 1,00 | 35 |
| 100×4,6 | 1,16 | 1,00 | 23 |
| 50×4,6 | 0,58 | 1,00 | 12 |
| 250×4,0 | 2,20 | 1,00 | 44 |
| 125×4,0 | 1,10 | 1,00 | 22 |
| 250×2,0 | 0,55 | 0,25 | 44 |
| 150×2,0 | 0,33 | 0,25 | 26 |
| 50×2,0 | 0,11 | 0,25 | 9 |
Puede optimizarse el acondicionamiento a la mitad de flujo del marcado en la tabla, pero manteniendo los 20 volúmenes de columna.
Mantenimiento del fritado
Después de la utilización prolongada de las columnas de HPLC, a menudo se dan subidas de presión. En la mayoría de los casos la causa es la obturación del fritado. En tal caso hay que desmontar el cabezal de la columna y extraer el fritado. En lugar del fritado embozado se coloca un fritado nuevo. Los fritados no deberían ser reutilizados. Si no quedase más remedio que reutilizarlo, se aconseja limpiarlo en un baño ultrasónico durante 5 min. En cada uno de los diferentes disolventes (por ejemplo: heptano, THF, metanol, agua). Existen diferentes diseños de columnas, terminales, fritados y sistemas de colocación de estos últimos.
Control de la capacidad de separación
Si surge la duda de si una columna aún dispone de una capacidad de separación suficiente, se aconseja comprobar la misma mediante una “mezcla de patrones”. Las mejores condiciones de comparación se lograrán utilizando la misma “mezcla de patrones” empleada en el chequeo de la columna. Para el cálculo de los platos teóricos sólo tenemos que aplicar la siguiente fórmula:
2. Almacenamiento de las columnas para HPLC
Las columnas de HPLC se entregan acondicionadas con una fase móvil definida y pura. El disolvente utilizado viene indicado en el cromatograma de control como “eluyente”. Si la columna ha de ser guardada durante un periodo largo, debería ser sometida a un acondicionamiento mediante una fase móvil definida, estable y tolerada. Para fase reversa se recomiendan metanol o acetonitrilo con un 20% de agua, para fase normal, hexano, heptano o tetrahidrofurano. 100% Agua y soluciones tampón no son adecuadas. Ello se debe a la limitada estabilidad de la gel de sílice, posible corrosión del acero y el crecimiento bacteriano.
3. Regeneración de una columna
Impurezas de la muestra o de la fase móvil pueden quedar adsorbidas en cabeza de columna y causar cambios en selectividad o desdoblamientos de picos. Esto se observará, además, por un aumento considerable de la presión en condiciones iniciales de fase móvil. A menudo, estas “columnas sucias” pueden ser regeneradas aplicando unos de los siguientes protocolos:
Regeneración de rellenos fase reversa
Columnas C18, C8, C4, C1, C30, CN y fenilo
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de agua: ACN 50:50
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de acetonitrilo.
• Pasar por la columna 5 volúmenes de columna de isopropanol.
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de acetonitrilo.
Regeneración de rellenos fase normal
Columnas Silica, amino (si se utilizan en fase reversa, con agua, se debería seguir el protocolo de rellenos RP), diol y nitro
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de heptano.
• Pasar por la columna 5 volúmenes de columna de isopropanol.
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de acetonitrilo.
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de heptano.
Regeneración de columnas de intercambio iónico
Columnas de intercambio aniónico y catiónico (WCX, SCX, WAX y SAX)
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna del mismo eluyente pero con doble concentración de tampón.
• Seguir el protocolo de regeneración de las columnas RP (ver más arriba).
• Pasar por la columna 20 volúmenes de columna de agua.
• Equilibrar la columna con las condiciones originales.
Puede dirigir sus consultas o comentarios a: Scharlab División Cromatografía cromato@scharlab.com
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