Reactivos y disolventes para la síntesis de oligonucleótidos
1 de febrero de 2024La pureza, un factor decisivo en la eficiencia de la síntesis
La eficiencia en la síntesis de oligonucleótidos depende en gran medida de la pureza de los reactivos y del bajo contenido en agua de los disolventes empleados. En Scharlab ofrecemos una gama de reactivos y disolventes anhidros diseñados para maximizar el rendimiento y la reproducibilidad en la síntesis de oligos.
¿Qué son los oligonucleótidos y para qué sirven?
Los oligonucleótidos se utilizan cada vez más para investigación en biología molecular requiriendo reactivos y disolventes para la síntesis de oligonucleótidos específicos.
Los oligonucleótidos (también llamados oligos) son cadenas de ADN o ARN de secuencia corta, con una longitud entre 2 y 75 nucleótidos compuestos por una base nitrogenada, un carbohidrato y un fosfato. Estos ‘oligos’, como se les llama en el sector, se encuentran de manera natural en las células de los seres vivos, pero también se pueden sintetizar químicamente.
Los oligonucleótidos sintéticos tienen aplicación en los campos de la biología molecular y la medicina, desde el diagnóstico hasta su uso en fármacos y terapias.
Etapas de la síntesis de oligonucleótidos
La síntesis de oligonucleótidos se compone de 4 pasos:
Desbloqueo o destritilación (deblocking)
Activación o acoplamiento (coupling)
Bloqueo o protección terminal (también conocido como capping o taponado)
Oxidación
Importancia de usar disolventes anhidros
El rendimiento de la síntesis de oligonucleótidos está directamente relacionado con la cantidad de agua presente en dicha síntesis; motivo por el cual es altamente recomendable emplear disolventes y reactivos con un bajo contenido en agua.
La línea de reactivos y disolventes para la síntesis de oligonucleótidos Scharlau se fabrica siguiendo los más altos estándares de calidad y es sometida a rigurosos análisis de control de calidad especializados para garantizar su uso. Se presta especial atención a la pureza y a la baja cantidad de agua en todos los productos que puedan perjudicar al rendimiento de la síntesis.
¿Qué soluciones son necesarias para la síntesis de oligonucleótidos y cómo funcionan?
Las soluciones necesarias para la síntesis de oligos incluyen:
- Las soluciones de desbloqueo (deblocking solutions) eliminan el grupo protector (dimetoxitritilo o DMT) del extremo 5’, permitiendo la adición de la siguiente fosfaramidita. Las soluciones recomendadas de desbloqueo incluyen mezclas deblock de ácido tricloroacético (TCA) y de ácido dicloroacético (DCA) en diclorometano o tolueno.
- Los reactivos de activación o acoplamiento (activation/coupling solutions) se mezclan con las soluciones de fosforamidita durante el paso de extensión (acoplamiento). El activador reacciona con el grupo amidita 3’-P formando un intermedio altamente reactivo, que crea el enlace internucleotídico con el hidroxilo 5’ desmetilado del oligonucleótido en crecimiento. Habitualmente, se usan soluciones de DCI (4,5-dicianoimidazol), BTT (5-benciltiotetrazol), y ETT (5-etiltiotetrazol) en acetonitrilo.
- Soluciones de bloqueo o protección terminal (capping) del extremo 5’-OH para evitar que las cadenas no acopladas sigan creciendo y se formen secuencias erróneas. Se usan soluciones como Cap A, Cap B, Cap B1 y Cap B2 en acetonitrilo (ACN) o tetrahidrofurano (THF) que añaden un grupo acetilo a los 5’-OH desmetilados.
- Soluciones de oxidación (oxidation solutions) que promueven la oxidación de los fosfotriésteres trivalentes inestables en el extremo 3’ de la fosforamidita añadida hacia fosfotriésteres pentavalentes estables. Estas soluciones usan yodo (I2) como agente oxidante suave y agua como donador de oxígeno para estabilizar los nuevos enlaces nucleotídicos. Se usan soluciones como, por ejemplo, mezclas de THF, agua, piridina y yodo o agua, piridina y yodo.
- Soluciones de escisión (cleavage solutions) para liberar el oligo final en su extremo 5’-OH del soporte sólido. La unión a este permite el lavado y elución de reactivos entre etapas sin perder los oligos en formación. Se puede usar amoníaco o bien una solución de desprotección rápida (Fast Deprotection Solution) con amoníaco y metilamina (AMA) para tal fin. Además, el amoníaco elimina los grupos protectores residuales (e.g., β-cianoetilo) en los 3’-P y en bases como la adenina (A), citosina (C) y guanina (G).
- Disolventes y soluciones auxiliares ultrapuras y con bajo contenido de agua para garantizar el máximo rendimiento de la reacción de síntesis como acetonitrilo (ACN), diclorometano (DCM), piridina, tetrahidrofurano (THF), etc.
Tanto para ampliar estas informaciones como para solicitar otros productos o servicios escribe a consultas@scharlab.com.
FAQs
¿Qué es la síntesis de oligonucleótidos y cómo funciona?
La síntesis de oligonucleótidos es un proceso químico en fase sólida para producir oligos de ADN/ARN mediante ciclos de destritilación (deblocking), acoplamiento (coupling), protección terminal (capping) y oxidación. El proceso debe realizarse en condiciones de bajo contenido de agua para mayor eficiencia.
¿Por qué son críticos los disolventes con bajo contenido en agua?
El agua reduce la eficiencia de acoplamiento de manera que usar disolventes anhidros mejora el rendimiento y la calidad de los oligos.
Incluso cantidades tan bajas como trazas de agua provocan la hidrólisis de las fosforamiditas (reactivo necesario para la síntesis), lo que genera oligonucleótidos truncados y reduce el rendimiento de la reacción. Usar disolventes de alta pureza, y libres de agua (anhidros) garantiza una síntesis más eficiente, reproducible y de mayor calidad.
¿Qué son las fosforamiditas?
Las fosforamiditas son nucleótidos modificados en el grupo fosfato del extremo 3’ (3’-P) para facilitar su activación y en el grupo hidroxilo del extremo 5’ (5’-OH), protegido con un grupo dimetoxitritilo (DMT), para evitar reacciones indeseadas en este extremo.
Las fosforamiditas se incorporan durante la etapa de acoplamiento de la síntesis, reaccionando a través de su extremo 3’ activado con el grupo 5’-OH desprotegido de la cadena en crecimiento, incorporándose a esta como nucleótidos que conforman su estructura.
El grupo DMT de las fosforamiditas, que protege el 5’-OH, junto con el grupo fosforamidito en el 3’-P, permiten una síntesis controlada de los oligonucleótidos. La reacción entre las soluciones activadoras y el grupo 3’-P genera un intermediario altamente reactivo que ataca el grupo 5’-OH desprotegido de la cadena en crecimiento. Dado que el 5’-OH de la fosforamidita incorporada permanece protegido, la reacción se detiene tras la adición de un único nucleótido a la secuencia.
¿Qué métodos de purificación para oligonucleótidos hay?
Los métodos de purificación de oligonucleótidos dependen de la aplicación:
- La purificación por desalting (o desalinización) elimina residuos producto de la síntesis/polimerización del oligo a menudo mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Size Exclusion Chromatography, SEC). Habitualmente, es suficiente para PCR estándar y RT-PCR (Reverse Transcription PCR).
- La purificación con HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) de oligos aporta mayor pureza para PCR en tiempo real o cuantitativa (quantitative PCR, qPCR, o real time PCR), diagnósticos y ensayos moleculares. Para oligonucleótidos,
- Se purifica por PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) para máxima resolución en aplicaciones sensibles y secuenciación de ADN/ARN.
¿Para qué aplicaciones se usan los oligos sintéticos?
Los oligonucleótidos sintéticos tienen múltiples aplicaciones en investigación y diagnóstico:
- Primers (o cebadores) para PCR y qPCR
- Secuenciación de ADN/ARN
- Clonación y mutagénesis dirigida
- Sistemas de edición genética como CRISPR-Cas
- Fármacos basados en oligonucleótidos y terapias génicas
- Diagnóstico molecular y biomarcadores
¿Scharlab ofrece soluciones a medida para aplicaciones con requisitos especiales?
Sí, nuestro equipo de I+D desarrolla soluciones a medida y nuestro laboratorio certifica la calidad de nuestros productos para síntesis de oligonucleótidos, con sus respectivos certificados de análisis (CoA). Disponemos de reactores con capacidades entre 300 y 1200 L para ofrecer todo tipo de soluciones.
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