Consigli per la cura delle colonne KromaPhase
28 de Maggio de 2025La cura adeguata delle colonne per HPLC è estremamente importante per la loro durata e per la qualità delle analisi HPLC. Di seguito sono riportate alcune linee guida per l’uso, la conservazione e la rigenerazione delle colonne per HPLC.
1. Uso delle colonne per HPLC
La silice è un materiale ideale per le colonne HPLC poiché offre una buona stabilità meccanica, eccellenti proprietà chimico-fisiche superficiali, un’ampia gamma di funzionalizzazioni e compatibilità con numerosi solventi organici. Tuttavia, i seguenti punti sono fondamentali quando si lavora con colonne in silice:
Stabilità del pH
Le colonne per HPLC a base di silice sono generalmente stabili in un intervallo di pH compreso tra 2 e 8. Soluzioni tampone con pH superiori a 8 attaccano idroliticamente la matrice della silice. Anche pH inferiori a 2 provocano processi idrolitici, causando il distacco del rivestimento superficiale della fase legata. Le colonne di “nuova generazione” supportano un intervallo di pH più ampio. Ad esempio, le colonne KromaPhase C18 Scharlau consentono un intervallo di pH da 1 a 10.
Stabilità meccanica
Le fasi stazionarie a base di silice sono molto stabili meccanicamente. Colonne ben impaccate possono essere utilizzate a pressioni superiori a 400 bar (6000 psi) senza problemi. Tuttavia, è importante evitare sbalzi di pressione che possono creare percorsi preferenziali all’interno della colonna, causando la scissione dei picchi cromatografici.
Preparazione del campione
È essenziale filtrare il campione con un filtro a siringa prima di introdurlo nel sistema. Per colonne con diametro interno di 4 o 4,6mm, si consiglia un filtro da 0,45μm. Per colonne con diametro di 3 o 2mm, è preferibile un filtro da 0,2μm.
Dopo l’uso, la colonna deve essere lavata, condizionata, rimossa dal sistema e sigillata ermeticamente.
Condizionamento della colonna
Il tempo di condizionamento di una colonna dipende dalle sue dimensioni. In generale, una colonna cromatografica si ritiene condizionata dopo il passaggio di 20 volte il suo volume. Nella tabella seguente sono dettagliati i tempi di condizionamento necessari per le dimensioni di colonna più comuni.
Fasi mobili (eluente)
Le colonne per HPLC a base di silice sono compatibili con tutti i solventi organici entro l’intervallo di pH sopra menzionato. Per ottenere i migliori risultati, è necessario utilizzare solventi di grado HPLC filtrati a 0,45μm. Ricorda che la colonna accumulerà tutte le particelle presenti nel flusso del sistema. L’uso di una precolonna prolunga notevolmente la durata della colonna principale, filtrando le particelle provenienti dalla pompa, dall’iniettore o dal campione stesso. Un’alternativa alla precolonna è il filtro in linea, che viene posizionato tra la colonna e l’iniettore. Alcune miscele tampone possono essere estremamente corrosive per l’acciaio inossidabile. Citrato, tartrato e ioni cloruro dovrebbero essere evitati. Quando possibile, sostituire questi tamponi con miscele a base di fosfati. Anche gli altri componenti del sistema HPLC ne trarranno beneficio. Se non si può evitare di lavorare in condizioni sfavorevoli, si raccomanda di non lasciare la colonna a contatto con questi eluenti per un lungo periodo. Le soluzioni tampone devono essere rimosse con acqua li prima possibile, seguite dal ri-condizionamento della colonna con un solvente adatto.
| Dim. colonna (mm) | Vol. colonna (ml) | Flusso (ml/min) | Tempo (min) di equilibrio |
| 250×4,6 | 2,91 | 1,00 | 58 |
| 150×4,6 | 1,74 | 1,00 | 35 |
| 100×4,6 | 1,16 | 1,00 | 23 |
| 50×4,6 | 0,58 | 1,00 | 12 |
| 250×4,0 | 2,20 | 1,00 | 44 |
| 125×4,0 | 1,10 | 1,00 | 22 |
| 250×2,0 | 0,55 | 0,25 | 44 |
| 150×2,0 | 0,33 | 0,25 | 26 |
| 50×2,0 | 0,11 | 0,25 | 9 |
Per ottimizzare il condizionamento, il flusso può essere ridotto alla metà di quello indicato nella tabella, mantenendo comunque i 20 volumi di colonna.
Manutenzione del fritto
Dopo un utilizzo prolungato, le colonne per HPLC possono mostrare un aumento della pressione. Nella maggior parte dei casi, ciò è dovuto all’intasamento del fritto. In tal caso, rimuovere la testa della colonna ed estrarre il fritto. Sostituire il fritto ostruito con uno nuovo. I fritti non devono essere riutilizzati, ma se necessario, possono essere puliti in un bagno a ultrasuoni per 5 minuti in diversi solventi (es. eptano, THF, metanolo, acqua). Esistono diversi design di colonne, terminali e sistemi di fissaggio del fritto.
Controllo della capacità di separazione
Se si sospetta che una colonna abbia perso la sua capacità di separazione, è consigliabile verificarla con una “miscela di riferimento”. Le condizioni migliori per il confronto si ottengono utilizzando la stessa miscela impiegata per il controllo iniziale della colonna. Il numero di piatti teorici può essere calcolato con la seguente formula:
2. Conservazione delle colonne per HPLC
Le colonne HPLC vengono fornite pre-condizionate con una fase mobile definita e pura. Il solvente utilizzato è indicato nel cromatogramma di controllo como “eluente”. Se una colonna deve essere conservata per un lungo periodo, deve essere condizionata con una fase mobile definita, stabile e compatibile. Per le colonne a fase inversa, si raccomanda metanolo o acetonitrile con il 20% di acqua, mentre per le colonne a fase normale si consiglia esano, eptano o tetraidrofurano. Solventi 100% acqua e soluzioni tampone non sono adatti a causa della stabilità limitata della silice, della possibile corrosione dell’acciaio e della proliferazione batterica.
3. Rigenerazione della colonna
Impurità del campione o residui della fase mobile possono essere assorbiti dalla testa della colonna, alterando la selettività o causando la scissione dei picchi. Ciò si manifesta anche con un significativo aumento della pressione nelle condizioni iniziali della fase mobile. Spesso, queste “colonne sporche” possono essere rigenerate seguendo uno dei seguenti protocolli:
Rigenerazione dei riempimienti a fase inversa
Colonne C18, C8, C4, C1, C30, CN e fenile
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di acqua: ACN 50:50
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di acetonitrile.
• Far passare attraverso la colonna 5 volumi di colonna di isopropanolo.
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di acetonitrile.
Rigenerazione dei riempimenti a fase normale
Colonne Silice, aminé (se utilizzate in fase inversa con acqua, seguire il protocollo per le fasi RP), diolo e nitro
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di eptano.
• Far passare attraverso la colonna 5 volumi di colonna di isopropanolo.
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di acetonitrile.
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di eptano.
Rigenerazione delle colonne a scambio ionico
Colonne a scambio anionico e cationico (WCX, SCX, WAX e SAX)
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna dello stesso eluente ma con una concentrazione di tampone doppia.
• Seguire il protocollo di rigenerazione delle colonne RP (vedi sopra).
• Far passare attraverso la colonna 20 volumi di colonna di acqua.
• Equilibrare la colonna con le condizioni originali.
Può indirizzare le sue richieste o commenti a: Scharlab Divisione Cromatografia cromato@scharlab.com
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